Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal di dinding selnya. Ketika diwarnai dengan kristal violet, lapisan ini mampu mempertahankan pewarna tersebut setelah proses pencucian dengan alkohol atau aseton. Akibatnya, bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu. Sementara itu, Bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang jauh lebih tipis sehingga Ketika dilakukan pencucian dengan alkohol atau aseton, membran luar bakteri Gram negatif hancur, dan lapisan tipis peptidoglikan tidak mampu mempertahankan pewarna kristal violet. Setelah itu, pewarna kontras safranin digunakan, yang membuat bakteri Gram negatif berwarna merah.